روش های آنالیز

روش های آنالیز

انواع مختلفی از روش های تجزیه و تحلیل مایکوتوکسین در غذا و خوراک وجود دارد. این تکنیک ها شامل: آزمایشات رپید که انجام آن ها آسان است و روش های رفرنس که زمان بیشتری صرف می کنند اما نتایج دقیق تری را ارائه می دهند، می باشد.

روش کلی آزمایش شامل پنج مرحله اصلی است: نمونه برداری، آسیاب کردن، استخراج، خالص سازی و آنالیز. نمونه برداری حساس ترین مرحله است و به دلیل توزیع ناهمگن مایکوتوکسین ها ناحیه ی مورد نظر، این امر باید طبق دستورالعمل های خاص انجام شود. پس از جمع آوری نمونه، باید آن را با استفاده از آسیاب مخصوص طراحی شده برای این کار آسیاب کرد. مرحله بعدی استخراج است که در آن مولکول های مورد نظر از سایر مولکول ها جدا می شوند. این مرحله با استفاده از بافرهای مختلف استخراج انجام می شود که در آن ها فقط ماده مورد نظر (به عنوان مثال مایکوتوکسین خاص) محلول است. پس از استخراج مایکوتوکسین، باید خالص شود. مرحله خالص سازی از نظر فیزیکی ماده مورد نظر را از محلول جدا می کند. روش های خالص سازی شامل استفاده از ستون هایی است که با مخلوط جاذب ها ترکیب شده اند. مایکوتوکسین از ستون عبور می کند و با مواد خاصی واکنش می دهد (به ستون متصل می شوند) که مخصوص اتصال مایکوتوکسین طراحی شده است. پس از ثابت شدن مایکوتوکسین، می توان آن را تجزیه و تحلیل کرد.

روش های تحلیلی مایکوتوکسین

تست جریان جانبی

آزمایشات جریان جانبی متشکل از فناوری نسبتاً ساده ای است که بر اساس مجموعه ای از کاغذهای متخلخل ساخته شده است. اولین عنصر (پد فیلتر) به عنوان یک اسفنج عمل می کند و محلول نمونه را جذب می کند. مایع به دومین عنصر (پد طلا) منتقل می شود، جایی که ذرات فعال زیستی (مزدوج) وجود دارند (یک ماتریس خشک مخصوص ایجاد واکنش شیمیایی بین مولکول مورد نظر (مایکوتوکسین) و آنتی بادی تثبیت شده بر روی سطح پد طلا). مایکوتوکسین به آنتی بادی باند می شود و قسمت بیشتر آن از طریق غشا به سمت پد جاذب مهاجرت می کنند. غشاء دارای یک یا چند ناحیه است (که به آن نوارها گفته می شود) که در آن سومین مولکول “گرفتن” نصب شده است. هنگامی که مخلوط نمونه-آنتی بادی به این نوارها می رسد، سومین مولکول “کپچر” به آن ­ها متصل می شود. با عبور بیشتر مایع از نوارها، ذرات تجمع یافته و رنگ نوارها تغییر می کند. به طور معمول، حداقل دو نوار وجود دارد. نوار شاهد که به هر ذره ای متصل می شود، در نتیجه نشان می دهد که واکنش درست انجام می شود. نوار دوم شامل یک مولکول جذب اختصاصی است که فقط برای اتصال به مجموع نمونه-آنتی بادی طراحی شده است. مزایا و معایب آزمایشات جریان جانبی در جدول زیر نشان داده شده است:

سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم  (ELISA)

ELISA یکی از رایج ترین روش های مبتنی بر ایمنی است که برای تجزیه و تحلیل مایکوتوکسین ها در خوراک استفاده می شود. واکنش در میکروپلیت های 96 خانه انجام می شود. ترکیب مورد نظر به عنوان مثال آفلاتوکسین B1 موجود در نمونه تحویل داده شده به آزمایشگاه، با آنتی بادی های خاصی که در چاهک های میکروپلیت قرار گرفته اند واکنش نشان می دهد. این آنتی بادی ها برای اتصال به آفلاتوکسین B1 طراحی شده اند. بطور کلی در واکنش، آفلاتوکسین B1 موجود در محلول با آفلاتوکسین B1 نشان دار که عمداً به واکنش اضافه شده است بر سر آنتی بادی رقابت می کند. این آفلاتوکسین B1 نشان دار توسط شرکت سازنده با یک مولکول برچسب گذاری می شود که در صورت برانگیختن مناسب یک محلول مایع خاص، یک سیگنال قابل تشخیص که معمولاً تغییر رنگ است ایجاد کند. محلول نمونه و مایکوتوکسین برچسب دار به چاهک های واکنش اضافه می شوند و اجازه می دهند تا برای مدت معینی (معمولاً چند دقیقه) با آنتی بادی ها رقابت کنند. پس از آن، چاهک ها شسته می شوند تا مایکوتوکسین های متصل نشده از بین بروند و محلول مایع مخصوصی که برچسب مولکولی را تحریک می کند، برای تولید رنگ اضافه می شود. در نتیجه، هرچه آفلاتوکسین B1 در نمونه بیشتر باشد، رنگ روشن تر خواهد بود، زیرا فقط مقدار کمی آفلاتوکسین B1 با برچسب به آنتی بادی متصل می شود. برعکس، اگر نمونه حاوی آفلاتوکسین B1 نباشد، رنگ تیره تر می شود، زیرا آفلاتوکسین B1 با برچسب بیشتر به آنتی بادی متصل می شود. مزایا و معایب این روش در زیر جدول زیر ذکر شده است:

فلورومتری

 فلورومتری اجازه می دهد تا مواد کوچک را با تحریک توسط پرتوی اشعه ماوراء بنفش شناسایی کرده و به دنبال آن طول موج مشخصه نور فلورسنت ساطع شده را اندازه گیری می کند. این روش زمانی که فرصت کوتاه است، به عنوان مثال: بارهای کامیون ورودی در فصل برداشت اهمیت دارد. مزایا و معایب آن در زیر ذکر شده است:

کروماتوگرافی لایه نازک  (TLC)

کروماتوگرافی لایه نازک یک تکنیک جداسازی است که در آن ماده مورد نظر (به عنوان مثال مایکوتوکسین) توسط برخی از مواد اتصال دهنده، معروف به فاز ساکن، که در یک ماتریس (مانند ژل سیلیکا) تثبیت شده اند، به دام می افتد.  این روش بر روی یک صفحه (به عنوان مثال شیشه یا آلومینیوم)، با یک لایه نازک از مواد جاذب پوشش داده شده است. نمونه ی قابل آنالیز شامل یک حلال حاوی آنالیت است (حلال + مجموعه آنالیت فاز متحرک نامیده می شوند). هنگامی که فاز متحرک روی صفحه اعمال می شود، نیروی مویینگی باید حلال را به طرف بالا بکشد. در این مرحله، مواد موجود در فاز متحرک با فاز ثابت واکنش می دهند. همانطور که مواد مختلف با سرعت های مختلف از صفحه TLC بالا می روند، جداسازی حاصل می شود.

کروماتوگرافی گازی  (GC)

این روش به تجهیزات خاص و تکنسین های آموزش دیده نیاز دارد. در این روش یک گاز همراه با ترکیب مورد نظر موجود در یک نمونه تزریق شده (فاز متحرک) را حمل می کند. گاز حامل نمونه از طریق یک ستون شیشه ای گرم شده که با مایع غیر فرار ثابت (فاز ساکن) پوشانده شده است جریان می یابد. مواد با توجه به توانایی آن ها برای عبور از مرحله ثابت (فرآیندی که به عنوان شستشو شناخته می شود) جدا می شوند. ترکیبات جدا شده از ستون توسط یک سیستم تشخیص شیمیایی یا فیزیکی تشخیص داده می شوند.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) 

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا توانایی جداسازی و شناسایی ترکیبات موجود در یک مخلوط را با استفاده از فاز متحرک مایع (حلال) و فاز ساکن جامد (ستون) دارا می‌باشد. اجزای مختلف نمونه، به عنوان مثال مایکوتوکسین ها، با مواد جاذب به طرق مختلف (تفاوت در گرایش) تعامل دارند. بنابراین از ستون با سرعت های مختلف عبور کرده و اجازه جدا شدن آن ها از ستون را می دهد. پس از آن، یک دتکتور مانند اسپکتوفتومتر نتایج را با استانداردهای انتخاب شده مقایسه می کند.

کروماتوگرافی مایع – طیف سنجی جرمی متناوب (LC -MS/MS)

این تکنیک ترکیبی از قابلیت های جداسازی فیزیکی HPLC با قابلیت تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی (MS) است. دو روش تحلیلی به صورت هم افزایی عمل می کنند. کروماتوگرافی مخلوط ها را با اجزای متعدد (به عنوان مثال مایکوتوکسین ها) جدا می کند، قبل از اینکه طیف سنج جرمی ویژگی های ساختاری اجزای فردی را با حساسیت و ویژگی بالا ارائه دهد. رایج ترین تغییرات این روش عبارتند از: کروماتوگرافی مایع همراه با طیف سنجی جرمی (LC-MS) یا طیف سنجی جرمی متناوب(LC-MS/MS) . درLC-MS/MS ، نسبت جرم به بار یون های متعلق به مایکوتوکسین های جداگانه قبل از قطعه قطعه شدن اندازه گیری می شود. هر قطعه در مرحله طیف سنج جرمی مجدداً برای ویژگی بیشتر اندازه گیری می شود. با توجه به حساسیت فوق العاده، این روش در بسیاری از آزمایشگاه ها روش مرجع انتخابی است و در حال حاضر نشان دهنده­ ی پیشرفته ترین علم شیمی تحلیلی است.